Estudo das vesículas extracelulares de Toxoplasma gondii e a correlação com o sistema imune de hospedeiros infectados / Study of extracellular vesicles of Toxoplasma gondii and the correlation with the immune system of infected hosts

As vesículas extracelulares (EVs) são nanopartículas produzidas e liberadas por células eucarióticas e procarióticas com propriedades biológicas. EVs desempenham um papel importante no sistema imunológico, transporte de moléculas e comunicação celular. A fim de compreender a participação das EVs na resposta imune durante a infecção por Toxoplasma gondii, este estudo teve com objetivo, investigar as respostas humoral e celular, em camundongos imunizados com EVs liberadas por taquizoítos e desafiados com T. gondii. As EVs de T. gondii (EVs-toxo) foram purificadas a partir de taquizoítos mantidos em culturas celulares. A seguir, um grupo de camundongos foi imunizado com as EVs-toxo e Alum como adjuvante (EV-IM). Como controles, o grupo negativo (N) recebeu somente Alum e os camundongos do grupo positivo (CHR) foram infectados com a cepa ME-49. O grupo EV-IM apresentou altos níveis de IgG1 do que IgM ou IgG2a. IgGs purificadas de soros destes camundongos foram capazes de opsonizar taquizoítos (cepa RH) e, quando os camundongos foram desafiados com a cepa RH tiveram a mortalidade atrasada em 48h. Células do cérebro e do baço deste grupo expressaram mais IFN-y, IL-10 e TNF-α. As EVs dos soros destes camundongos foram purificadas por ultracentrifugação. As análises das EVs de camundongo (EVs-mouse) mostraram que as concentrações de EVs liberadas de soros do grupo N foram menores que as do grupo EV-IM e a presença de exossomos foi confirmada pelo immunoblot das EVs. Esplenócitos de camundongos foram estimulados com EVs-toxo. Esplenócitos dos camundongos do grupo EV-IM expressaram mais IFN-y; TNF-α e IL-17, que os do grupo N. Curiosamente, a IL-10 foi altamente expressa apenas em esplenócitos do grupo EV-IM. Os resultados da expressão gênica de microRNAs (miRNAs) mostraram que os camundongos do grupo EV-IM expressaram mais miR-155-5p, miR-29c-3p e miR-125b-5p do que os do grupo N. Todos esses dados sugerem a participação das EVs na interação T. gondii-hospedeiro. Além disso, os miRNAs liberados pelas EVs interagem com a modulação da resposta imune celular anti T. gondii. A imunização com EVs foi capaz de induzir proteção imunológica. Esses dados fornecem subsídios para propor a diferenciação entre hospedeiros infectados e não infectados pela concentração de EVs. (AU)

Extracellular vesicles (EVs) are nanoparticles produced and released by eukaryotic and prokaryotic cells with biological properties. EVs play an important role in the immune system, transport of molecules and cellular communication. In order to understand the participation of EVs in the immune response during Toxoplasma gondii infection, this study aimed to investigate the humoral and cellular responses in mice immunized with EVs released by tachyzoites and challenged with T. gondii. T. gondii EVs (toxo-EVs) were purified from tachyzoites maintained in cell cultures. Then, a group of mice was immunized with EVs-toxo and Alum as an adjuvant (EV-IM). As controls, the negative group (N) received only Alum and the mice in the positive group (CHR) were infected with strain ME-49. The EV-IM group had higher levels of IgG1 than IgM or IgG2a. IgGs purified from the sera of these mice were able to opsonize tachyzoites (RH strain) and, when mice were challenged with the RH strain, mortality was delayed by 48h. Brain and spleen cells from this group expressed more IFN-γ, IL-10 and TNF-α. The EVs from the sera of these mice were purified by ultracentrifugation. Analysis of mouse EVs (mouse EVs) showed that the concentrations of EVs released from sera from the N group were lower than those from the EV-IM group and the presence of exosomes was confirmed by the immunoblot of EVs. Mouse splenocytes were stimulated with EVs-toxo. Splenocytes from EV-IM group mice expressed more IFN-y; TNF-α and IL-17 than those of the N group. Interestingly, IL-10 was highly expressed only in splenocytes of the EV-IM group. The results of gene expression of microRNAs (miRNAs) showed that mice in the EV-IM group expressed more miR-155-5p, miR-29c-3p and miR-125b-5p than those in the N group. participation of EVs in T. gondii host interaction. Furthermore, miRNAs released by EVs interact with the modulation of the cellular immune response against T. gondii. Immunization with EVs was able to induce immune protection. These data provide subsidies to propose the differentiation between infected and uninfected hosts by the concentration of EVs. (AU)

Reference genes for studies in infectious parasitic diseases in five types of human tissues

Gene expression analyses based on messenger RNA (mRNA) expression require accurate data normalization. When using endogenous reference genes, these should be carefully validated. Validated reference genes vary greatly depending on tissue, cell subsets and experimental context. This study was aimed to identify reference genes that have more stable mRNA levels among individuals in peripheral blood mononuclear cells (PBMC); fresh skin biopsies; lung and brain autopsies as well as, skin biopsies formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE). Therefore, 6 endogenous reference genes were evaluated by quantitative real-time polymerase chain reaction: 18S rRNA, glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH), TATA box-binding protein (TBP), beta-2-microbolin (B2M), ubiquitin C (UBC) and mitochondrially encoded ATP synthase 6 (MT-ATP6). Furthermore, validation of their stabilities and performance as reference genes was determined by geNorm and NormFinder programs. The results show that the most stable genes for PBMC and fresh skin biopsies were TBP and UBC; in FFPE lung autopsies and skin biopsies were GAPDH and B2M; and in FFPE brain autopsies were GAPDH and UBC. In addition, 18S rRNA was the least stable of all genes analyzed. These data concluded that even genes constitutively expressed have transcript level variations in different tissues as well as storage and experimental conditions. These observations suggest that suitable reference genes should be selected for normalization of gene expression data analysis.

As análises de expressão gênica baseadas na expressão do RNA mensageiro (mRNA) requerem normalização precisa dos dados. Ao usar genes de referência endógenos, estes devem ser cuidadosamente validados. Os genes de referência validados variam muito, dependendo do tecido, subconjuntos de células e contexto experimental. Este estudo teve como objetivo identificar genes de referência que apresentam níveis de mRNA mais estáveis ​​entre indivíduos em células mononucleares do sangue periférico (PBMC); biópsias de pele fresca; autópsias pulmonares e cerebrais, bem como biópsias de pele fixadas em formalina e embebidas em parafina (FFPE). Portanto, 6 genes de referência endógenos foram avaliados por reação quantitativa em cadeia da polimerase em tempo real: rRNA 18S, gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (GAPDH), proteína de ligação à caixa TATA (TBP), beta-2-microbolina (B2M), ubiquitina C (UBC) e ATP sintase 6 mitocondrialmente codificada (MT-ATP6). Além disso, a validação de suas estabilidades e desempenho como genes de referência foi determinada pelos programas geNorm e NormFinder. Os resultados mostram que os genes mais estáveis ​​para PBMC e biópsias de pele fresca foram TBP e UBC; nas autópsias pulmonares de FFPE e biópsias de pele foram GAPDH e B2M; e nas autópsias cerebrais de FFPE foram GAPDH e UBC. Além disso, o 18S rRNA foi o menos estável de todos os genes analisados. Esses dados concluíram que mesmo os genes expressos constitutivamente apresentam variações no nível de transcrição em diferentes tecidos, bem como condições experimentais e de armazenamento. Essas observações sugerem que genes de referência adequados devem ser selecionados para normalização da análise dos dados de expressão gênica.

Expressão gênica de citocinas em pacientes com toxoplasmose sintomática

Este estudo avaliou os níveis de expressão de mRNA de 9 citocinas empacientes com toxoplasmose ocular e disseminada. Foram analisadas 77 amostrasclínicas divididas em 4 Grupos. Foram incluídos no estudo amostras de autopsiasparafinadas de cérebro e pulmão provenientes de 11 pacientes com a coinfecçãotoxoplasmose disseminada e AIDS (Grupo I). As células mononucleares do sangueperiférico (PBMC) foram isoladas de 23 pacientes com toxoplasmose ocular (GrupoII) e 9 indivíduos com toxoplasmose crônica) (Grupo III). A seguir, as amostras dePBMC foram estimuladas in vitro com antígeno de Toxoplasma gondii. Os controlesnegativos (Grupo IV) foram constituídos por 7 amostras de PBMC de indivíduossoronegativos para toxoplasmose e 16 amostras de tecido parafinado (cérebro epulmão) de pacientes negativos para toxoplasmose e HIV. A expressão de mRNApara IFN-γ, TNF-α, TGF-β, IL-4, IL-6, IL-10, IL-12, IL-17 e, IL-27 foi determinadapor qPCR. Os resultados mostraram um aumento significativo dos níveis deexpressão de mRNA de IL-6 e IL-10 nos pacientes com toxoplasmose ocular.Esses pacientes também apresentaram menor expressão de mRNA de IFN-γ doque os indivíduos crônicos. Nos pacientes com a coinfecção toxoplasmosedisseminada e AIDS foram detectados níveis de expressão de mRNA de TGF-β eIL-6 no cérebro e pulmão. IL-6 foi significativamente menor do que o TGF-β. Até omomento, este é o primeiro estudo a investigar a resposta imune de pacientes comtoxoplasmose sintomática através do perfil de expressão de mRNA das citocinasde interesse.

This study evaluated levels of mRNA expression of 9 cytokines from patientswith ocular and disseminated toxoplasmosis. A total of 77 clinical samples wasanalyzed and they were divided into 4 Groups. The Group I was constituted ofautopsy samples (cerebral and pulmonary paraffin tissues) from 11 patients withdisseminated toxoplasmosis and AIDS. The peripheral blood mononuclear cells(PBMC) were isolated from 23 patients with ocular toxoplasmosis (Group II) and 9individuals with chronic toxoplasmosis (Group III). Next, PBMC samples werestimulated with in vitro with a crude Toxoplasma gondii antigen. Negative controls(Group IV) consisted of 7 PBMC from patients seronegative for toxoplasmosis and16 paraffin tissue samples (brain and lung) from patients negative for toxoplasmosisand HIV. mRNA expression for IFN-γ, TNF-α, TGF-β, IL-4, IL-6, IL-10, IL-12, IL-17and IL-27 was determined by qPCR. The results showed a significant increase inlevels of mRNA expression for IL-6, IL-10 and TGB-β in patients with oculartoxoplasmosis. These patients also had lower mRNA expression for IFN-γ thanthose chronic individuals. In patients with disseminated toxoplasmosis and AIDS,levels of mRNA expression for TGF-β and IL-6 were detected in the brain and lung.IL-6 was significantly lower than TGF-β. To date, this is the first study to investigatean immune response of patients with symptomatic toxoplasmosis through themRNA expression profile of the cytokines of interest.